Презентация "Технология рекомбинации ДНК" – проект, доклад

ТЕХНОЛОГИЯ РЕКОМБИНАции ДНК

МОЛЕКУЛЯРНОЕ КЛОНИРОВАНИЕ или ГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ

Herbert Boyer Courtesy Genentech

Stanley Cohen, Stanford University professor

Показали, что объединив генетические элементы из разных источников (организмов), можно создать новую реплицирующуся генетическую структуру с новыми свойствами.

Общий принцип рекомбинации ДНК

ОСНОВНЫЕ СТАДИИ ТЕХНОЛОГИИ РЕКДНК в биотехнологическом производстве ЛС

Ферменты, используемые в технологии рекомбинации ДНК

РЕСТРИЦИРУЮЩИЕ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ (рестриктазы) ДНК-лигаза БАКТЕРИОФАГА Т4

ТАТА ТТGAC ТАС Сайт-промотор Сайт-терминации

ИНИЦИАЦИЯ ТРАНСКРИПЦИИ

Терминация транскрипции

АТТ АТС

При молекулярном клонировании важно, чтобы расщепление донорной и векторной ДНК происходило в строго определенных участках ДНК (сайтах) с образованием дискретного и воспроизводимого набора нуклеотидов.

Ген регуляции

Если разрез ДНК окажется внутри гена, то такой разрез приведет к его инактивации

Расщепление ДНК рестриказой EcoRI

Образование «липких» концов

EcoRI гуанин

Рестриктазы и расщепляемые ими последовательности ДНК

крупнощепящая мелкощепящая

Расщепление ДНК рестриказой Hind II

Hind II

«т у п ы е» к о н ц ы

ФРАГМЕНТЫ ОБРАЗУЮЩИЕСЯ ПРИ РАСЩЕПЛЕНИИ ДНК РАЗНЫХ ОРГАНИЗМОВ РЕСТРИКТАЗОЙ BamHI

Фрагменты ДНК «слона»

Фрагменты ДНК «лягушки»

рекДНК

Лигирование липких концов ДНК-лигазой Т4

Лигирование тупых концов ДНК-лигазой Т4

Расщепление молекул ДНК рестриктазой и соединение полученных фрагментов ДНК-лигазой.

Объединение разных молекул ДНК само по себе бесполезно, если вновь образованные рекДНК не будут реплицироваться в клетке-хозяине и экспрессироваться.

Для доставки чужеродных генов в клетки различных организмов применяют ВЕКТОРЫ.

Как полученные гибридные гены ввести в клетку и заставить там работать – производить белки?

Клонирующие векторы

Vehicle – англ. , повозка , транспортное средство

Вектор (в технологии рекДНК)

Это молекула ДНК, способная самостоятельно реплицироваться в клетках различных организмов и обеспечивать клонирование (размножение) и экспрессию встроенного в нее искусственно какого-либо гена

Плазмидные векторы

ПЛАЗМИДЫ

Плазмидный вектор pBR322 создатели - Боливар Ф., Родригес Р.

Технология рекомбинации ДНК с применением плазмидного вектора

клеток E. Coli или др. реципиентов

ФРАГМЕНТЫ ОБРАЗОВАВШИЕСЯ ПРИ РАСЩЕПЛЕНИИ ДНК РАЗНЫХ ОРГАНИЗМОВ РЕСТРИКТАЗОЙ BamHI

Фрагменты ДНК плазмиды

Фрагменты донорной ДНК

Модификации плазмидных векторов

Для всех рутинных процедур молекулярного клонирования широко используют E.coli в качестве клетки-хозяина. Но часто могут выступать и другие бактерии, например Bacillus subtilis. Клетки, способные воспринять чужеродную ДНК, называются компетентными. Часто в векторы, которые функционируют в кишечной палочке, встраивают второй сайт ORIGIN, который инициирует их репликацию в других клетках (не в кишечной палочке). Эти так называемые ЧЕЛНОЧНЫЕ ВЕКТОРЫ позволяют сначала проводить внедрение рекДНК в клетки кишечной палочки, а затем в клетки других бактерий. Созданы плазмидные вектора, которые содержат универсальный сайт origin для широкого спектра хозяев. Их можно использовать для работы с разными микроорганизмами. С помощью плазмидных векторов можно клонировать фрагменты ДНК длиной до 10 т.п.н. Однако часто приходится работать с более крупными фрагментами.

Векторы на основе бактериофага

Структура бактериофага λ Escherichia coli. Схема

Бактериофаг λ Escherichia coli

«Портрет» электронномикроскопический

Инфицирование фагом λ клетки E.coli

После адсорбции фага на поверхности клетки белковый отросток (чехол) сокращается, проталкивая стержень внутрь клетки. Через стержень фаговая ДНК проникает внутрь клетки. Процесс облегчается благодаря местному повреждению клеточной стенки фаговым лизоцимом. Некоторые вирусы впрыскивают в клетку свою ДНК, другие проникают в нее сами.

После проникновения фага λ в клетку кишечной палочки возможны 2 сценария развития событий: лизис или лизогения