Презентация "Основы генетической инженерии" – проект, доклад

Основы генетической инженерии

Тема 2. Ферменты генетической инженерии

Группы ферментов, применяемые при конструировании рекомбинантных ДНК:

ферменты, с помощью которых получают фрагменты ДНК (рестриктазы); ферменты, синтезирующие ДНК на матрице ДНК (полимеразы) или РНК (обратные транскриптазы); ферменты, соединяющие фрагменты ДНК (лигазы); ферменты, позволяющие осуществить изменение структуры концов фрагментов ДНК.

Тема №2

Рестриктазы

{рестрицирующие эндонуклеазы, эндонуклеазы рестрикции} это ферменты, узнающие и атакующие определенные последовательности нуклеотидов в молекуле ДНК (сайты рестрикции).

в 1970 г. Смит и Вилькокс выделили из Haemophilus influenzae первую рестриктазу, которая расщепляла строго определенную последовательность ДНК (Hind III).

Метилаза добавляет метильные группы к адениновым или цитозиновым остаткам в том же сайте, в котором связывается рестрикционный фермент. В результате метилирования сайт становится устойчивым к рестрикции, т.е. метилирование защищает ДНК от разрезания.

ДНК-метилазы dam-метилазы

осуществляет перенос метильных групп в N-положение аденина в последовательности GATC. В таком случае многие рестриктазы (например, BclI, MboI или ClaI), в состав сайтов рестрикции которых входит данная метилированная последовательность, перестают расщеплять ДНК по этим сайтам.

dcm-метилазы

Аналогичное действие на некоторые рестриктазы, например EcoRII, оказывает и dcm-метилаза, осуществляющая метилирование остатков цитозина по положению С5 в последовательностях CCAGG и CMe--CTGG.

Для того чтобы избежать нежелательного влияния этих метилаз на клонируемые ДНК, в качестве хозяев используют мутантные штаммы E. coli: dam и dcm. ДНК-метилазы бактериальных систем рестрикции и модификации применяют для блокирования in vitro соответствующих сайтов рестрикции на исследуемых фрагментах ДНК с целью получения под действием гомологичных рестриктаз фрагментов больших размеров.

Классификация рестриктаз

Все рестриктазы узнают на двуспиральной ДНК строго определенные последовательности 1 класс. Осуществляют разрывы в произвольных точках молекулы ДНК. Имеют сложную субъединичную структуру и обладают двумя типами активностей - модифицирующей (метилирующей) и АТФ-зависимой эндонуклеазной. 2 класс. Узнают и расщепляют ДНК в строго определенных точках внутри сайтов узнавания или на фиксированном от них расстоянии. состоят из 2 отдельных белков: рестрицирующей эндонуклеазы и модифицирующей метилазы, поэтому в генной инженерии используются исключительно ферменты 2-го класса. Они нуждаются в ионах Mg в качестве кофакторов. 3 класс. Узнают и расщепляют ДНК в строго определенных точках внутри сайтов узнавания или на фиксированном от них расстоянии. имеют сложную субъединичную структуру и обладают двумя типами активностей - модифицирующей (метилирующей) и АТФ-зависимой эндонуклеазной.

Изошизомеры - среди ферментов, выделенных из различных микроорганизмов, встречаются такие, которые узнают на ДНК одни и те же последовательности. Гетерошизомеры - ферменты, узнавая один и тот же сайт на ДНК, производят разрывы в разных точках в пределах того же сайта.

Номенклатура рестриктаз

1) Аббревиатура названия каждого фермента является производной от бинарного названия микроорганизма, содержащего данную метилазнорестриктазную систему. Составляют по правилу: к первой прописной букве названия рода добавляют две первые строчные буквы вида. Streptomyces albus - Sal, Escherichia coli - Eco 2) В случае необходимости добавляют обозначение серотипа или штамма, например, Есо B. 3) Различные системы рестрикции - модификации, кодируемые одной бактериальной клеткой, обозначают римскими цифрами: Hind II, Hind I, Hind III (Haemophilus influenzae). 4) Рестриктазы обозначают буквой R (R Hind III), метилазы - М (М Hind III).

Сайт рестрикции (участок узнавания)

короткая последовательность нуклеотидов в молекуле ДНК, которая распознаётся ферментом эндонуклеазой рестрикции-модификации (рестриктазой). Рестриктаза связывается с молекулой ДНК в точке расположения сайта рестрикции и перерезает цепочку нуклеотидов внутри сайта или в непосредственной близости от него. Размер сайта рестрикции различных рестриктаз составляет, как правило, 4-6 нуклеотидов. Сайты рестрикции в ДНК самой бактерии замаскированы посредством метилирования остатков А и С. Например, фермент рестрикции EcoRI распознаёт симметричную последовательность GAATTC и перерезает цепочку между нуклеотидами G и A, оставляя на концах перекрывающиеся участки AATT.

Механизм действия рестриктаз

В качестве мишеней (сайт узнавания) часто выступают палиндромы из 46 пар оснований - сайты рестрикции. Сайт-мишень может быть полностью метилирован (обе цепи модифицированы), полуметилирован (только одна цепь метилирована) или не метилирован.

Реакция разрезания осуществляется в две ступени. Сначала разрезается одна цепь ДНК, а затем рядом разрезается другая. В областях, прилегающих с каждой стооны к сайту разрезания, может иметь место экзонуклеотическая деградация. Происходит эффективный гидролиз АТФ, роль которого еще не выяснена.

Полимеразы

ферменты, катализирующие образование макромолекул из низкомолекулярных веществ. Фермент состоит из мономерной полипептидной цепи с молекулярной массой 109 кДа и имеет 3-х доменную структуру. Каждый домен обладает своей ферментативной активностью: 5’ – 3’ полимеразной, 3’ – 5’ экзонуклезной, 5’ – 3’ экзонуклеазной.

ДНК-полимераза I E. coli

а) структура б) модель взаимодействия с молекулой ДНК

Функции ДНК-полимеразы

5’-3’ полимеразная активность. Для реакции необходимо наличие одноцепочечной ДНК-матрицы и комплементарного участку этой цепи фрагмента — праймера (затравки) с 3'-ОН концом. 3’- 5’ экзонуклеазная активность. Гидролизует одноцепочечную или двухцепочечную ДНК с 3'-ОН конца. 3’-5’ нуклеаза расщепляет диэфирную связь только в неспаренных участках ДНК. 5‘-3' экзонуклеазная активность. Деградирует одну цепь двухцепочечной ДНК, начиная со свободного 5'-конца. В отличие от 3'—5' экзонуклеазы 5'—3' экзонуклеаза расщепляет диэфирную связь только в спаренных участках двухцепочечной молекулы ДНК.

Обратная транскриптаза (ревертаза, РНК-зависимая ДНК-полимераза)

- фермент, катализирующий синтез ДНК на матрице РНК в процессе обратной транскрипции

Обратную транскриптазу используют для транскрипции мРНК в кДНК

Схема синтеза двухцепочечных ДНК-копий молекул РНК.

Лигазы

фермент, катализирующий соединение двух молекул с образованием новой химической связи (лигирование). При этом обычно происходит отщепление (гидролиз) небольшой химической группы от одной из молекул.

ДНК-лигазы разделяют на два семейства в зависимости от используемого ими кофактора в качестве донора AMP:

ATP-зависимые лигазы обнаруживают у бактериальных и эукариотических вирусов, архей, дрожжей, млекопитающих и эубактерий. NAD-зависимые ДНК-лигазы имеются почти исключительно у эубактерий. Единственное известное исключение в этом отношении составляют энтомопоксвирусы насекомых Melanoplus sanguinipes и Amsacta moorei.

Полинуклеотидкиназы

- осуществляют перенос -фосфатных групп ATP на 5’-OH группы ДНК или РНК. Полинуклеотидкиназа бактериофага Т4 используется для введения радиоактивной метки в ДНК или РНК с целью получения радиоактивно меченых зондов или секвенирования нуклеиновых кислот.

Терминальная трансфераза

Осуществляет последовательное присоединение АМР из пула дезокси-рибонуклеозид-трифосфатов к 3’-OH-группам молекул ДНК

Щелочные фосфатазы.

- Катализируют удаление 5’-фосфатных групп ДНК или РНК, а также расщепление макроэргических связей рибо- и дезоксирибонуклеозидтрифосфатов.

Нуклеазы в генной инженерии.

Экзонуклеаза III E. coli Экзонуклеаза фага  Нуклеаза S1 из Aspergillus orizae Панкреатическая рибонуклеаза A (РНКаза A) Панкреатическая дезоксирибонуклеаза I (ДНКаза I)