Презентация "Серологические реакции" по медицине – проект, доклад

СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ

СПбГУ 2013г.

Сложности диагностики

получение ложноотрицательного результата : неправильное взятие материала, несвоевременная доставки его в лабораторию, несовершенная методика бактериологического исследования угнетение жизнеспособности или гибели возбудителя под действием проводимого лечения (если материал берется не в первые дни заболевания, а уже на фоне этиотропной терапии)

получение ложноположительного результата : контаминация материала бактериооносительство выделение условно-патогенных микроорганизмов

Выделенный микроорганизм является возбудителем, если: подтверждена триада Коха многократность обнаружения данных видов, массивность роста бактерий в высевах на плотные питательные среды, антигенная и фаговаровая однородность выделяемых субкультур диагностического нарастания титров гомологичных антител при серологических исследованиях.

Микробиологические методы диагностики делятся на:

методы прямого обнаружения возбудителя в организме больного — бактериоскопическое и бактериологическое исследования; методы косвенного доказательства наличия возбудителя в организме больного —иммунологические исследования, направленные на обнаружение специфических антигенов в инфицированном материале или антител в сыворотке крови и различных секретах организма больного.

Бактериоскопическое исследование

Бактериологический метод

ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ, СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ (лат. serum сыворотка + logos учение) – методы изучения определенных антител в сыворотке крови больных, выявления антигенов микроорганизмов или тканей с целью их идентификации, основанные на реакциях иммунитета.

Строение антител (Ig)

Строение и классы иммуноглобулинов

В основе иммунологических реакций лежит специфическое взаимодействие антигена с антителом.

ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ ТЕСТ-СИСТЕМЫ

При определении антигена - минимальная концентрация вещества, определяемая данной тест-системой. При определении антител – процент образцов, давших положительный результат в данной тест-системе, от общего количества обследованных образцов, содержащих выявляемые антитела.

СПЕЦИФИЧНОСТЬ ТЕСТ-СИСТЕМЫ

Процент образцов, давших отрицательный результат в данной тест-системе, от общего количества обследованных образцов, действительно не содержащих выявляемый маркёр.

ППЗ и ОПЗ

Положительное прогнозируемое значение (ППЗ) – вероятность того, что пациент с положительным результатом анализа действительно болен (инфицирован). Отрицательное прогнозируемое значение (ОПЗ) – вероятность того, что пациент с отрицательным результатом анализа действительно здоров (не инфицирован).

ЗАВИСИМОСТЬ ППЗ И ОПЗ ОТ РАСПРОСТРАНЁННОСТИ ЗАБОЛЕВАНИЯ

Сыворотка крови

Пробирки - контейнеры для получения сыворотки крови

Варианты иммунологических реакций:

Прямые, основаны на взаимодействии антигена с антителом (агглютинация, преципитация) Опосредованные реакции или непрямые, взаимодействие атнигена и антитела через посредника (реакция непрямой гемагглютинации, реакция связывания комплемента) Реакции с использованием меченых антител или антигенов (иммуноферментный, радиоиммунный анализ, метод флюоресцирующих антител).

Реакция агглютинации, варианты:

Ориентировочная РА Развернутая РА Реакция Кастеллани РНГА РЛА Реакция Кумбса Ко-агглютинации

Реакция агглютинации (ориентировочная, для идентификации микроорганизма)

1 2

Отсутствие агглютинации 2. Наличие агглютинации

Физ. р-р + культура микроорганизмов Сыворотка (1:100) + культура микроорганизмов

Возможна спонтанная агглютинация – R-формы бактерий

Развернутая реакция агглютинации

КSV Кдиагностикум +++ ++ + -

А. Кастеллани

метод Кастеллани (A. Castellani, р. 1878 г., итал. врач) — метод извлечения противобактериальных антител из иммунной сыворотки крови путем их сорбции на убитых бактериях соответствующего штамма (удаление АТ, реагирующих с групповыми АГ); применяется для изучения антигенных свойств бактерий, главным образом кишечной группы, а также для изготовления моноспецифических сывороток.

Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА)

Метод обнаружения и идентификации антигенов или антител, основанный на возникающем в их присутствии феномене агглютинации эритроцитов, на поверхности которых были предварительно адсорбированы соответствующие специфические антитела или антигены. Отличается большей чувствительностью и специфичностью.

1. АГ (АТ) +эритроциты нагруженные эритроциты

2. Нагруженные эритроциты + иммунная сыворотка или АГ

Положительная Реакция (зонтик)

Отрицательная Реакция (пуговка)

Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА) – или пассивная гемагглютинация (РПГА)

Эр Аг Ат

Эритроцитарный диагностикум

зонтик Сыворотка

РНГА в иммунологическом планшете на выявление HBsAg.

Постановка и результат РНГА.

Условные обозначения: - нет гемагглютинации (пуговка) ; - есть гемагглютинация (зонтик).

Тест-система для проведения РНГА

Нормальная сыворотка

Реакция торможения гемагглютинации (РТГА)

метод идентификации вирусов или выявления противовирусных антител в сыворотке крови больного. в присутствии иммунной к вирусу сыворотки крови агглютинация эритроцитов отсутствует

Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) (схема).

Результаты РТГА при типировании вируса гриппа

Условные обозначения: - торможение гемагглютинации (пуговка) ; - гемагглютинация (зонтик).

Исследуемый материал содержит вирус гриппа тип А с антигеном H3N2

Результаты реакции учитывают по отсутствию гемагглютинации.

Определение титра антител крови больного по РТГА

Титр антител определяют по последней лунке с положительной РТГА.

титр антител равен 1:40.

Реакция латекс-агглютинации (РЛА)

Частицы латекса (искусственные эритроциты) используют в качестве носителя АГ. Ревматоидный фактор - это аутоантитела анти-IgG (к Fc-фрагменту IgG) , относящиеся к классу IgM. В сыворотке ревматоидный фактор обычно присутствует в виде комплекса с IgG. В высоком титре ревматоидный фактор выявляется в крови у 80% больных с тяжелым прогрессирующим ревматоидным артритом .

Реакция коагглютинации (РКА)

В качестве носителя используются: Белок А S.aureus (неспецифически адсорбирует на своей поверхности Fc-фрагменты иммуноглобулина G) Белок G стрептококков Инертные носители (активированный уголь)

Схема реакции коагглютинации

Реакция Кумбса с неполными антителами (бруцеллез, резус-конфликт)

Антиглобулиновая сыворотка

Занятие №2

Реакция преципитации

Осаждение специфических мелкодисперсных антигенов эквивалентным количеством антител (в присутствии электролита) Варианты: в жидкой среде - по типу реакции флокуляции, кольцепреципитации в плотной среде в агаре (геле).

Реакции преципитации:

кольцепреципитации реакция флокуляции реакция преципитации в геле по Оухтерлони, радиальная иммунодиффузия по Манчини, реакция иммуноэлектрофореза

Реакция кольцепреципитации.

Реакция преципитации в растворе

Реакция кольцепреципитации

Реакция преципитации в капиллярных пробирках (флокуляция)

Реакция преципитации в геле по Оухтерлони

Реакция преципитации в геле по Манчини

Реакция иммуноэлектрофореза .

Прибор иммуноэлектрофоретический ПИЭФ-1

(вирусный гепатит, клещевой энцефалит, менингококковая инфекция и др.).

Реакция иммунного лизиса: Реакция связывания комплемента (РСК)

Реакция Борде— Жангу [по имени бактериологов Ж. Борде (J. Bordet) и О. Жангу (О. Gengou), 1901], высокоспецифичная и очень чувствительная серологическая реакция, основанная на свойстве комплекса антиген — антитело фиксировать свободный комплемент, применяемая при диагностике многих бактериальных и вирусных и некоторых протозойных и гельминтозных болезней, а также для изучения процессов, сопровождающихся изменением количества антигена или антител.

РСК протекает в 2 фазы: Взаимодействие АТ, АГ и комплемента, в результате которого свободный комплемент связывается образовавшимся комплексом АГ—АТ (специфич. фаза); индикация реакции сенсибилизир. эритроцитами (неспецифич. фаза). В РСК используют 2 системы: специфич. бактериол., состоящую из АТ (испытуемой сыворотки), АГ и комплемента, а также неспецифич. “индикаторную”, содержащую гемолизин (гемолитич. сыворотка) и взвесь эритроцитов барана. АГ соединяется с АТ только в присутствии комплемента. Если испытуемая сыворотка содержит АТ, гомологичные взятому АГ, то присутствующий в реагирующей смеси комплемент адсорбируется образующимся комплексом АГ—АТ и теряет способность лизировать сенсибилизированные эритроциты, т. е. без комплемента гемолизин (гемолитич. антитело) не разрушает эритроциты (реакция положительная). В тех случаях, когда между АГ и АТ испытуемой сыворотки нет специфич. родства, комплекс не образуется и комплемент остаётся в свободном состоянии. При добавлении гемолитич. системы в этом случае несвязанный комплемент вызывает гемолиз сенсибилизированных эритроцитов (реакция отрицательная).

Реакция связывания комплемента

Реакция положительная

Реакция отрицательная

Реакция Вассермана (RW) относится к группе реакций связывания комплемента (А. Р. Wassermann, нем. бактериолог, 1866-1925) - иммунологическая реакция, применяемая в диагностике сифилиса)

Результаты реакции Вассермана: а - полная задержка гемолиза (+ + ++); б - выраженная задержка гемолиза (+ ++); в - частичная задержка гемолиза (++); г - слабая задержка гемолиза (+); д - полный гемолиз «лаковая кровь» (-). Реакция положительна при частичной, выраженной и полной задержке гемолиза, определяемой по степени окрашивания содержимого пробирок от светло-розового до ярко-красного. Негемолизированные эритроциты впоследствии образуют осадок красного цвета.

Иммунофлюоресцентный метод Кунса

Иммунофлюоресцентный анализ(метод Кунса)- или реакция иммунофлюорисценции(РИФ):

Прямой флюорисцирующие АТ+ исследуемый АГ Непрямой – универсальная флюорисцирующая сыворотка + специфические АТ +исследуемый АГ

Светящийся комплекс

Иммунофлюоресцентный анализ

Радиоиммунный анализ (РИА) твердофазный.

Высоко чувствительный метод. Применяют для количественного определения различных веществ : гормонов, белков сыворотки крови, лекарственных препаратов, микробных антигенов. Изотоп – 125 I.

АТ АГ АГ*

Меченный радионуклеотидом АГ

антиген антитело Твердая фаза

Иммуноферментный анализ (ИФА)

Содержание набора (Сифилис ИФА 96)

Промывающий раствор

Субстрат

Положительный и отрицательный контроли

Стоп- раствор

Буфер для разведения коньюгата

Коньюгат

Стрипированный микропланшет

Схема иммуноферментного анализа твердофазный вариант

Определение антител в сыворотке больного с сорбированным антигеном

Определение антигена в сыворотке больного с сорбированными диагностическими антителами

Конкурентный вариант ИФА для определения антигенов

Иммунологические планшеты, используемые для постановки ИФА

Автоматический биохимический и иммуноферментный анализатор