Презентация "Иммунологические реакции" – проект, доклад

Иммунологические реакции

Кафедра микробиологии и вирусологии фгбоу ВО ТГМУ 2016г

план

1. Серологические реакции, которые используются для серологической диагностики. 2.Серологические реакции, которые используются для серологической идентификации. 3.Современные методы Иммунологических исследований при инфекционных болезнях: (Иммунолюминесцентный и Иммуноферментный анализ, генодиагностика, полимеразная цепная реакция). 4.Серологические реакции, которые используются в вирусологии.

Все серологичные реакции используются с двоякой целью:

для выявления антител в сыворотке больного с помощью стандартных антигенов-диагностикумов – для серологической диагностики инфекционной болезни; для определения неизвестных антигенов (бактерий, грибов, вирусов) за известными стандартными сыворотками-антителами – для серологической идентификации возбудителей.

классифиация

Иммунные реакции подразделяются на простые и сложные. Для их постановки необходимы основные два компонента: антиген и антитело. К простым реакциям, применяемым для диагностики, относятся реакции агглютинации, реакции преципитации, реакции нейтрализации. К сложным реакциям – иммунофлюоресцентный метод, радиоиммунный метод, иммуноферментный метод, иммунолюминесцентный метод исследования, метод иммуноблотинга.

Реакция агглютинации

Реакция агглютинации (agglutinacio — склеивание) внешне проявляется в склеивании и выпадении в осадок корпускулярных антигенов: бактерий, эритроцитов, а также частиц с адсор­бированными на них антигенами под влиянием антител в среде с электролитом. Реакция протекает в две фазы. В первой фа­зе происходит специфическая адсорбция антител на поверхности клетки или частицы, несущей соответствующие антигены, Во второй — образование агрегата (агглютината) и выпадение его в осадок, причем этот процесс происходит только в присутствии электролита (раствор хлорида натрия).

Агглютинат

Агглютинат может быть двух типов - мелкозернистый и крупнохлопчатый. Мелкозернистый – это результат взаимодействия мелких бактерий, крупнохлопчатый – бактерий, имеющих жгутики.

Реакция агглютинации-типы

Все реакции агглютинации подразделяются на два типа: ориентировочные (ОРА), которые выполняются на стекле, развернутые (РРА) – выполняются в пробирках с титрованием сыворотки.

Реакция агглютинации недостаточно специфична и чувстви­тельна.

Повысить специфичность и чувствительность реакции можно путем разведения исследуемой сыворотки до ее титра или половины титра. Титром сыворотки называется то ее максимальное разведение, в котором обнаруживается агглютинация антигена. Чем выше титр антител, тем достовернее результаты реакции. Чтобы дифференцировать причину положительной реакции (ранее перенесенная инфекция, вакцинация или текущее заболевание), оценивают динамику нарастания титра антител, которое наблюдается только при текущей инфекции..

Основные цели

Ориентировочные реакции также могут иметь две цели: Идентификация микробного вида (с использованием известной иммунной сыворотки). Поиск антител в сыворотке крови пациента с использованием известного микробного диагностикума.

ОРИЕНТИРОВОЧНЫЕ РЕАКЦИИ АГГЛЮТИНАЦИИ

ОРА - ориентировочной реакции агглютинации

Схема ориентировочной реакции агглютинации.

Этапы выполнения реакции: На обезжиренное стекло нанести каплю физиологического раствора. Внести петлей исследуемую культуру бактерий, равномерно распределить в капле физиологического раствора Добавить каплю специфической агглютинирующей иммунной сыворотки Учесть результат реакции. Положительной считается реакция, когда в капле происходит просветление жидкости и формирование агглютината.

ИНТЕНСИВНОСТЬ ОБРАЗОВАНИЯ АГГЛЮТИНАТА

модификации Реакция агглютинации : это реакция Минкевича и реакция Хеддельсона.

Реакция Минкевича позволяет определить наличие противотуляремийных антител у инфицированного пациента. Необходимые ингредиенты: Капля крови пациента, взятая при помощи скарификатора из пальца больного Дистиллированная вода Туляремийный диагностикум.

Этапы выполнения реакции Минкевича :

На обезжиренное стекло нанести каплю крови пациента Добавить каплю дистиллированной воды для лизиса эритроцитов Внести каплю туляремийного диагностикума Учесть результаты. Положительной считается реакция, если в капле образуются зерна агглютината.

ПОСТАНОВКА РЕАКЦИИ ХЕДДЛЬСОНА ПРИ БРУЦЕЛЛЕЗЕ

Реакция Хеддельсона позволяет не только выявить антитела в сыворотке инфицированного бруцеллезом пациента, но и определить титр антител. Необходимые ингредиенты: Сыворотка пациента Физиологический раствор Бруцеллезный диагностикум

Принцип метода

основан на использовании большого стекла фотопластины, концентрированной неразведённой сыворотки крови больного в нарастающих или уменьшающихся объёмах, дополняемой до определённого уровня физиологическим раствором, что приравнивается к разным разведениям, и окрашенного метиленовым синим диагностикума для лучшей видимости образующегося агглютината. Ускорение реакции достигается смешиванием ингредиентов путём лёгкого покачивания стекла и помещения его в термостат при +37Сº. На одном стекле одновременно проводят анализ сывороток от нескольких больных. Результат получают через 2-5 минут в виде голубого агглютината разной активности в зависимости от разведений.

реакцию адсорбции агглютининов по Кастеллани применяют для детального изучения антигенной структуры бактерий с целью определения их серовара :

Данная реакция основана на способности родственных групп бактерий адсорбировать из антисыворотки только группо­вые антитела при сохранении в ней типоспецифических анти­тел. Полученные сыворотки называются монорецепторным, так как содержат антитела только к одному определенному антигену. При наличии у разных бактерий одинаковых или сходных групповых антигенов они могут агглютинироваться одной и той же антисывороткой, что затрудняет их идентификацию.

Принцип метода: Перекрёстная РА направлена на извлечение групповых антител методом адсорбции специфический антиген (АГ) изымает из сыворотки все антитела — и специфические только для него, и групповые; неспецифический АГ — только групповые. В данной реакции наряду со специфическим антигеном используют родственные гетерологические АГ. Например, у больного брюшным тифом (Т) сыворотка крови дала агглютинацию со специфическим диагностикумом Т и с групповым паратифа А.

Реакция агглютинации латекса (РАЛ) экспресс-метод выявления антигенов и антител(ориентировачный вариант)

Для постановки РАЛ используют сенсибилизованные частицы полистиролового латекса диаметром 0,5-1,2 мкм, которые в присутствии гомологичного иммунологического реагента (антигена или антитела) склеиваются. Эта реакция происходит достаточно быстро – на протяжении 2-7 мин. Нагруженные антителами частицы латекса широко используются для выявления антигенов вирусов и бактерий. Нагружая латекс антигенами, можно определять наличие антител в сыворотке больного. Такую модификацию РАЛ используют для выявления противогриппозных, противокраснушных, протикоревых антител и т.д.

Проведение реакции латекс-аглютинации

Реакция коагглютинации (КОА) .

Для постановки КОА используют золотистые стафилококки (штамм Cowan 1). В клеточной стенке этих микроорганизмов содержится белок А, который имеет значительное родство к Fc фрагменту IgG человека и кролика. Поэтому молекулы IgG после адсорбции на стафилококках, которые имеют белок А, ориентированные в окружающую среду своими свободными Fab фрагментами, в которых находится активный центр антитела.

Реакцию ставят на стеклянных пластинках, смешивая одинаковые объемы (1-2 капли) исследуемого материала (кровь, моча, слюна, фильтраты фекалий и др.) и стафилококкового диагностикума. Смесь тщательно перемешивают и через 2-5 мин. на тёмном фоне должна четко будет просматриваться мелкозернистая агглютинация стафилококков.

РЕАКЦИЯ НЕПРЯМОЙ (ПАССИВНОЙ) ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ наиболее из чувствительных серологических реакций

Основана на способности антител взаимодействовать с антигеном, фиксированным на различных эритроцитах, которые при этом агглютинируют. Для постановки этой реакции необходимо приготовление эритроцитарного диагностикума. Эритроцитарный диагностикум может быть двух видов: антигенный и антительный.

Этапы выполнения реакции:

Необходимые ингредиенты: Сыворотка крови инфицированного пациента Физиологический раствор Эритроцитарный диагностикум Реакция пассивной гемагглютинации выполняется в лунках иммунологического планшета.

В лунки планшета внести физиологический раствор в одинаковом количестве -0,25 мл для разведения сыворотки В первую лунку внести сыворотку крови пациента, разведенную в 50 раз в объеме 0,25 мл; перемешать содержимое пипеткой и этой же пипеткой набрать 0,25 мл и перенести в следующую лунку Перемешать содержимое и повторить эту процедуру во всех лунках, предназначенных для проведения реакции. Приготовить контроль, для чего в одну лунку внести 0,25 мл физиологического раствора Во все лунки, включая контрольную, внести по 2 капли приготовленного эритроцитарного диагностикума и перемешать путем осторожного покачивания планшета.

РЕАКЦИЯ НЕПРЯМОЙ (ПАССИВНОЙ) ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ

Положительной считается проба, когда в лунках планшета на дне в контроле эритроциты ложатся в виде «пуговки», а в опытных лунках появляется осадок в виде «зонтика». Схема постановки и учета РПГА

Критерии учета результатов реакции

РАЗВЕРНУТЫЕ РЕАКЦИИ АГГЛЮТИНАЦИИ.

Развернутые реакции агглютинации предложены для поиска антител в сыворотках крови инфицированных пациентов при некоторых бактериальных инфекциях. При этом применяются диагностикумы, приготовленные из микроорганизмов. Для выполнения этих реакций необходимо предварительное титрование сыворотки.

Для выполнения этих реакций необходимо предварительное титрование сыворотки.

Разведение 1:10 это 1мл сыворотки + 9 мл физ. раствора 1:50 это 1 мл сыворотки + 49 мл физ. раствора или 1:50 это 0,1 мл сыворотки + 4,9 мл физ. раствора 1:100 это 1 мл сыворотки + 99 мл физ. раствора или 1:100 это 0,1 мл сыворотки +9,9 мл физ. раствора. В 10 пробирок вносим по 2,5 мл физиологического раствора. 8 пробирок будут опытными, 2 – контрольными: контроль сыворотки и контроль антигена. В контроль сыворотки вносим только разведенную сыворотку в объеме 2,5 мл, в контроль антигена - только взвесь диагностикума.

Учет реакции

Затем во все пробирки, кроме контроля сыворотки, вносим по 1 мл взвеси диагностикума. В результате образования агглютината мутная жидкость в пробирках просветляется, на дно оседает осадок агглютината. Учет реакции начинается с контрольных проб: в контроле сыворотки должна быть прозрачная сыворотка, в контроле антигена- равномерно мутная взвесь диагностикума. Титр РРА учитывается по разведению сыворотки, в которой еще явственно видно формирование осадка агглютината.

СХЕМА ПОСТАНОВКИ РАЗВЁРНУТОЙ РЕАКЦИИ АГГЛЮТИНАЦИИ С СЫВОРОТКОЙ БОЛЬНОГО ПО ВИДАЛЮ (РАЙТУ)

Реакция преципитации отличается от агглютинации по характеру антигенов:

В реакции агглютинации они корпускулярные, даже целые клетки, а в реакции преципитации – молекулярные, в растворимом состоянии. Антигенами могут быть экстракты микроорганизмов, тканей, органов, химические вещества. Феномен преципитации заключается в том, что антитела (преципитины), соединяясь с растворимыми антигенами (преципитиногенами), предопределяют образование осадка (преципитата) или помутнения раствора. За титр реакции принимают наибольшее разведение антигена, которое дает положительный результат.

Феномен преципитации широко используется в микробиологической практике:

В судебно-медицинской экспертизе его применяют для определения видовой принадлежности крови: можно установить, какому виду принадлежит выявленная кровь. Определяют возможную фальсификацию продуктов (мясо, мед). Для диагностики эпидемического цереброспинального менингита, чумы, дизентерии, определения инфицированности возбудителем сибирской язвы продуктов и материалов животного происхождения (кожа, мех, щетина). Реакцию Ухтерлони используют для определения антигенного состава органов и тканей, как нормальных, так и опухолевых, количества антигенов в сложных системах. Она имеет важное значение в диагностике дифтерии, оспы и других заболеваний.

. Выявление АГ в реакции кольцепреципитации.

Реакция микропреципитации на примере экспресс-диагностики сифилиса (ЭДС).

Данная реакция выполняется для скрининга сывороток при массовых обследованиях на сифилис. В качестве антител применяются сыворотки крови пациентов, антигеном служит кардиолипиновый антиген (неспецифический). Реакция выполняется в лунках иммунологического планшета. Необходимо иметь два контроля: в первом в качестве ингредиентов применяется физиологический раствор и кардиолипиновый антиген (контроль мутности), во втором контроле – заведомо положительная сыворотка и кардиолипиновый антиген (контроль преципитата). В опытной лунке – изучаемая сыворотка больного, взятая в разведении 1:10 и кардиолипиновый антиген. После смешивания реагентов в течение 2-5 минут осторожно покачиваем планшет, в течение этого времени формируется преципитат, жидкость в лунке становится прозрачной. Учет реакции ведется по четырех плюсовой системе. Результат, оцениваемый как один и два плюса считается сомнительным, на 3 и 4 ++++ - положительным. Схема реакции микропреципитации представлена на рис. 10.

Экспресс-диагностика сифилиса (ЭДС).

Методика определения количества иммуноглобулинов в сыворотке крови (реакция Манчини)

Метод простой линейной иммунодиффузии основан на взаимодействии антисыворотки, содержащейся в геле агар-агара с раствором антигена образуют линии и полосы преципитации. Судя по ширине зон преципитации в тесте простой радиальной диффузии, можно проводить количественное определение антигенов. Взаимное рас­положение линий преципитации в тестах двойной и встречной иммунодиффузии позволяет оценивать иммунохимическое сходство или различие антигенных компонентов. Методы иммунодиффузии характеризуются высокой специфичностью и чувствительностью. Обычно тесты иммунодиффузии используют для идентификации белков в биологических жидкостях, таких как сыворотка крови, цереброспинальная жидкость, секреты желез или экстрак­ты различных органов и т. д.

Иммуноэлектрофорез

Метод объединяет реакцию преципитации в геле с электрофорезом. Для этого слой агара наносят на предметное стекло, на его разных краях вырезают две лунки, а в центре – разделяющую канавку. В лунки вносят смесь антигенов и проводят электрофорез в течение 1-2 часов. Различные антигены с разной скоростью перемещаются между катодом и анодом. Затем в канавку вносят преципитирующую сыворотку и через 5-7 суток в геле образуются зоны преципитации. Для лучшей визуализации агар окрашивают красителями (например, амидо черным).

Схема постановки иммуноэлектрофореза.

дуги преципитации.

Реакция бактериолиза

применяется редко, она используется для дифференциальной диагностики холерного вибриона от других холероподобных бактерий. В основе реакции лежит способность специфических антител образовывать иммунные комплексы с клетками, в том числе с бактериями, что приводит к активации системы комплемента по классическому пути и лизису бактерий.

В реакции гемолиза

антигеном служат эритроциты, антителом – антигемолитические антитела. При образовании комплекса антиген-антитело начинается активация комплемента, в результате чего мутная взвесь эритроцитов превращается в ярко-красную прозрачную жидкость – «лаковую» кровь вследствие выхода гемоглобина. При постановке диагностической реакции связывания комплемента (РСК) реакция гемолиза используется как индикаторная: для тестирования присутствия или отсутствия (связывания) свободного комплемента.

Реакция лизиса и связывание комплемента.

Необходимые антиген, антитело и комплемент. Антигеном могут быть микроорганизмы, эритроциты или другие клетки. Как антитело (лизин) используют специфическую сыворотку или сыворотку больного. В зависимости от того, против каких клеток направленное действие лизины, они имеют свои названия: против бактерий - бактериолизины, спирохет - спирохетолизины, эритроцитов - гемолизины, против других клеток - цитолизины. Комплемент при образовании комплекса клетка (антиген) - антитело, связывается с ним, активируется за классическим путем и вызывает растворение клетки. Без комплемента лизис клетки невозможен. Различают несколько реакций лизиса: бактериолиза, гемолиза, цитолиза.

Реакция связывания комплемента (РСК).

При образовании комплекса антиген - антитело к нему всегда присоединяется комплемент. Если антиген и антитело не отвечают друг другу, то комплемент не связывается, остается свободным в системе. При добавлении комплекса эритроциты барана - гемолизины свободный комплемент, связываясь с ним, вызывает гемолиз эритроцитов. Этот принцип и положено в основу РСК. При соответствии антигена антителу с ним связывается комплемент. Чтобы убедиться в этом, добавляют эритроциты барана и гемолитическую сыворотку. При отсутствии гемолиза заключают, что реакция положительная, при наличии гемолиза - реакция негативная.

(РСК)

Определение антирезус - антител в сыворотке.

Данная реакция проводится у беременных женщин, имеющих отрицательный резус-фактор. В случае, если у отца ребенка положительный резус-фактор, то у плода возможен как положительный, так и отрицательный резус. Для предотвращения резус-конфликта необходимо знать, образуются ли антирезус-антитела в течение беременности и если они образуются, то идет ли динамика нарастания их титра.

Для постановки данной реакции необходимы следующие ингредиенты

Исследуемая сыворотка Эритроциты человека, несущие положительный резус-фактор (стандартные эритроциты) Комплемент. Этапы постановки теста: В пробирку вносим 1 мл исследуемой сыворотки В каждую пробирку вносим 2% взвесь стандартных эритроцитов Добавляем одинаковое количество комплемента в рабочей дозе. В качестве положительного контроля используем сыворотку, имеющую антирезус-антитела; в качестве отрицательного контроля – заведомо отрицательную сыворотку.

Учет результата ведется по гемолизу:

В пробирке с отрицательным контролем наблюдаем осадок эритроцитов - В пробирке с положительным контролем – полный гемолиз, то есть равномерно окрашенная в красный цвет жидкость - В исследуемых образцах при наличии антирезус-антител – полный гемолиз, при их отсутствии – осадок эритроцитов.

РЕАКЦИЯ НЕЙТРАЛИЗАЦИИ ВИРУСОВ

Реакция широко применяется в вирусологии для определения вида (типа) воз­будителя и титра вируснейтрализующих антител. Эти антитела обычно выявляются при смешивании иммунной сыворотки с соответст­вующим вирусом с последующим введением этой смеси воспри­имчивым лабораторным животным или заражением культуры клеток. На основании выживания животного в первом случае или отсутствия цитопатического действия вируса во втором су­дят о нейтрализующей активности сыворотки.

Реакция торможения гемагглютинации (РТГА)

Основана на свойстве антисыворотки подавлять вирусную гемагглютинацию, так как нейтрализованный специфическими антителами вирус утрачивает способность агглютинировать эритроциты. РТГА ши­роко применяется для серодиагностики вирусных инфекций с целью обнаружения специфических антигемагглютининов и для идентификации многих вирусов по их гемагглютининам (анти­генам).

РЕАКЦИИ С УЧАСТИЕМ МЕЧЕНЫХ АНТИГЕНОВ ИЛИ АНТИТЕЛ

Участвуют меченые антигены или антитела. К ним относятся реакции иммунофлюоресценции, ра­диоиммунный иммуноферментный методы. По своей чувстви­тельности они превосходят все описанные выше серологические реакции.

Реакции иммунофлюоресценции (по Кунсу) метод экспресс-диагностики,

Для выявления микробных антигенов в тканях использовали меченую диагностическую сыворотку, содержащую антитела к определенным видам (ва­риантам) микроорганизмов (бактерий, вирусов). Метку антител производят флюорохромами(изотиоцианат флюоресцеина)

МЕТОД ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА – ИФА

включает использование коммерческих реагентов – антигенов или антител, маркированных ферментами (например, пероксидазой или щелочной фосфатазой). Метод выполняется в полистироловых планшетах, где в лунках фиксирован антиген или антитело. После образования иммунного комплекса в систему вносят субстрат, расщепляемый ферментом, что приводит к окрашиванию среды. В отличие от классических методов выявления, ИФА позволяет непосредственно регистрировать взаимодействие антигена с антителом в специфической фазе, а не анализировать вторичные проявления взаимодействия – агглютинацию, преципитацию или гемолиз. Метод отличает высокая чувствительность – обычно достаточно присутствия антигена в концентрации 1 нг мл.

Этапы выполнения реакции (на примере диагностики антител при ВИЧ-инфекции):

В лунки полистиролового планшета, на которых сорбирован антиген ВИЧ, вносят сыворотку крови пациентов. Первая лунка предназначена для внесения заведомо положительной сыворотки, вторая – заведомо отрицательной Инкубируем планшет во влажной камере в течение 30 минут Промываем лунки планшета фосфатно-солевым буфером 5 раз Вносим во все лунки антисыворотку, содержащую антитела против иммуноглобулинов человека, меченные ферментом Промываем лунки фосфатно-солевым буфером 5 раз Во все лунки добавляем субстрат, содержащий перекись водорода и бензидин Выдерживаем планшет 20 минут в темном месте Проводим визуальный учет результатов и определение оптической плотности раствора в каждой лунке с использованием прибора

При правильной постановке анализа в лунке, содержащей положительную контрольную сыворотку, меняется цвет - он становится желтым. В отрицательном контроле цвет прозрачный. Учет результатов опытных образцов зависит от изменения цвета в исследуемой лунке – если он меняется, как в положительном контроле, значит, у данного пациента обнаружены антитела к ВИЧ.

упрощения использования ИФА «безреагентные» системы

Для проведения анали­за необходимо только нанести на носитель образец и визуально наблюдать изменение окраски носителя, происходящее вслед­ствие образования продукта ферментативной реакции. Преимущества: не используются радиоактивные изотопы, стабиль­ность конъюгатов позволяет хранить их в течение длительного времени, измерение оптической плотности проводят в оптическом диапазоне, результаты ИФА можно оценивать полуколичественно без применения аппаратуры (визуально). ИФА очень легко под­дается автоматизации.

Радиоиммунологический анализ (РИА)

Преимущество РИА: отсутствует необ­ходимость оценивать протекающую реакцию по вторичным про­явлениям, таким как агглютинация, преципитация, лизис эритро­цитов . 2 варианта: меченый и немеченый антигены конкурируют за ограниченное число участков связывания со спе­цифическими антителами. Для того чтобы происходило конку­рентное взаимодействие, должна существовать определенная степень родства между меченым и немеченым антигеном. После двух этапов инкубации антител сначала с исследуемым, а затем со стандартным меченым антигеном количество включившегося в состав иммунных комплексов меченого антигена будет обратно пропорционально количеству немеченого антигена в исследуе­мой пробе..

Источники информации:

Основные А. .Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология. -С-П.,2000. Медицинская микробиология./ Под ред. В.И. Покровского.М., 2001. Л.Б.Борисов.Медицинская микробиология,вирусология,иммунология. М.,2001 Медицинская микробиология,вирусология /Под ред. А.А.Воробьева.М.2004.