Презентация "Система цитокинов. Методы оценки системы цитокинов." – проект, доклад

Система цитокинов. Методы оценки системы цитокинов.

Подготовил студент 471а группы Черепанов С.А. Москва 2010.

Ответ клетки на влияние цитокинов зависит от нескольких факторов: - от типа клеток и их исходной функциональной активности, - от локальной концентрации цитокина, - от присутствия других медиаторных молекул. Таким образом, клетки продуценты, растворимые цитокины и их антагонисты, клетки мишени и их рецепторы формируют систему цитокинов. Нарушения различных компонентов системы цитокинов приводит к развитию различных патологий, а следовательно, выявление деффектов в этой системе имеет важное значение для правильной постановки диагноза и назначения адекватной терапии.

Система цитокинов.

Клетки продуценты цитокинов: 1)основные продуценты в системе адаптивного иммунитета – лимфоциты 2)в системе врожденного иммунитета – клетки миелоидного ряда 3)клетки не относящиеся к иммунной системе

Лимфоциты. При распознавании аг и при участи рецепторных взаимодействий (СD28-CD80/86 для Т-лимфоцитов и СD-40 – CD40L для В-лимфоцитов) происходит активация клеток, приводящая к транскрипци генов цитокинов, трансляции и их секреции в межклеточное пространство. СD4 Т-хелперы представлены субпопуляциями Th0 (Т-лимфоцит), Th1, Th2, Th17, Tfh, различающихся между собой спектром секретируемых цитокинов. Th0 – не дифференцированная клетка. Остальные – эффекторные клетки. Направление дифференцировки Th0 регулируют природа аг, его концентрация, локализация в клетке, тип аг-презентирующих клеток ( пример - дендритные клетки) и определенный набор цитокинов.

1)Под действием ИЛ-12 происходит дифференцировка Th1 (LAG-3 маркер), которые начинают секретировать цитокины (ИЛ-2, ИФНγ, ИЛ-3, ФНОα, лимфотоксины), регулирующие развитие реакций на внутриклеточные патогены (ГЗТ и различные типы клеточной цитотоксичности). 2) ИЛ-4 обеспечивает дифференцировку Th0 в Th2(CD-30 маркер). Th2 вырабатывают цитокины, определяющие пролиферацию В-лимфоцитов, их дальнейшую дифференцировку в плазматические клетки, и развитие реакций антителогенеза на внеклеточные патогены. (ИЛ-4,5,6,13) 3) ИЛ-23,6 ТФРβ, вырабатываемы макрофагами и Дендритными клетками (ДК) обеспечивают дифференцировку Th0 в Th17, участвующим в развитии хронического воспаления и аутоиммунной патологии. 4)Кроме того Th0 могут дифференцироваться в естественные клетки регуляторы (CD4, CD25, FOXP3 транскрипционный фактор). Способны подавлять иммунный ответ, опосредуемый Th1 и Th2 клетками, путем прямого межклеточного контакта и синтеза ТФРβ, ИЛ-10.

Негативная регуляция.

В организме эти субпопуляции сбалансированы между собой. Избыточная активация одной из субпопуляций Th может определить развитие одного из вариантов иммунного ответа. При хронической несбалансированности активации Th могут формироваться иммунопатологические состояния, связаные с проявлениями аллергии, аутоиммунной патологи, хронических воспалительных процессов. Т-цитотоксические клетки (CD8+) слабые продуценты цитокинов –интерфероны, ФНОα, лимфотоксины. Можно подразделить на T-клетки (CD-8+), выделяющие тот же набор цитокинов, что Th1 и Th2.

Клетки миелоидного ряда являются основными продуцентами цитокинов в системе врожденного имунитета. С помощью Toll-подобных рецепторов (TLRs) они распознают молекулярные структуры патогенов (липополисахарид gr- бактерий, липотейхоевые кислоты, флагеллин…). В результате взаимодействия с TLRs запускается каскад внутриклеточных реакций, приводящих к экспрессии генов двух основных групп цитокинов: провоспалительных и ИФН типа 1. Это – ИЛ-1,6,8,12, ФНОα, ГМ-КСФ, ИФН, хемокины. Они индуцируют развитие воспаления и участвуют в защите организма от бактериальных и вирусных инфекций.

Клетки, не относящиеся к иммунной системе (клетки соед. ткани, эпителия, эндотелия) секретируют аутокринные факторы роста (ФРФ, ЕФР, ТФРβ) и цитокины, поддерживающие пролиферацию гемапоэтических клеток.

Сетевые взаимодействия цитокинов.

Особенности регуляции сетевых цитокиновых воздействий: -образование индивидуальных цитокинов происходит кратковремено и находится под жестким контролем, -разные цитокины действуют как синергисты или антагонисты, -каждый из цитокинов может индуцировать или ингибировать продукцию других цитокинов, -каждый из цитокинов способен регулировать экспрессию клеточных рецепторов для самого себя и для других цитокинов, -антагонисты цитокинов связываются со специфическими клеточными рецепторами, но не вызывают передачу внутриклеточного сигнала, -”децепторы” специфически связывают лиганд, но не передают сигнал внутрь клетки, -благодаря ферментативному отщеплению внеклеточные домены цитокиновых рецепторов могут покидать поверхность клетки и связываться со свободными молекулами многих цитокинов -интенсивность синтеза цитокинов до и после его стимуляци может быть также запрограммирована на генетическом уровне.

Растворимый рецептор, связывающийся с цитокином – это отщепленный ферментом внеклеточный домен мембранного рецептора, например для ФНОα, ИЛ-6. Растворимые рецепторы для ФНОα сохраняют высокую аффинность в отношении своих лигандов и благодаря этому способны нейтрализовать ФНО, препятствуя его доступу к интактным мембранным рецепторам. Если же ФНОα свяжется с одним из неспецифических растворимых рецепторов (фрагмент ИЛ-6Р), возникший комплекс может связаться с другим мембранным рецептором и все-же вызвать сигнальный эффект.

Рецепторы клеток-мишеней.

Действие цитокинов на клетки-мишени опосредуется высокоспецифичными высокоаффинными мембранными рецепторами, представляющими собой трансмембранные гликопротеины, состоящие обычно более чем из одной субъединицы. Каждый цитокин связывается со своим специфическим рецептором. Рецепторы цитокинов делятся на 5 основных типов.

1) Гемопоэтиновый тип. Наиболее распространен. К этому типу относятся рецепторы к ИЛ-2,-3,-4,-5,-6,-7,-9,-12, Г-КСФ, ГМ-КСФ. Как гетеротример экспрессирован на T-лимф памяти, некоторых В-лимф, NK.

2) Рецепторы семейства ИЛ-10 и ИФН. Могут иметь 2 внеклеточных домена с большим количеством консервативных цистеинов. 3) Цитокиновые рецепторы или рецепторы ФНО (TNFR). Представляют собой одну трансмембранную полипептидную цепь. Связывают ФНОα, ФНОβ, лимфотоксин, фактор роста нервов (ФРН). К рецепторам также относится Fas (CD-95), связывание которого с лигандом FasL служит сигналом к апоптозу.

R

4) Суперсемейство иммуноглобулиновых рецепторов. Внеклеточные домены напоминают домены молекул иммуноглобулинов. 5) Рецепторы для хемокинов. Представлены трансмембранными белками, пересекающими мембрану в 7 местах. Могут существовать в растворимой форме, сохраняя способность связывать лиганды. Рецепторы для ИЛ-8, МИФ-1,

Цитокины способны влиять на пролиферацию, дифференцировку, функциональную активность и апоптоз клеток-мишеней. Проявление биологической активности цитокинов в клетках-мишенях зависит от участия различных внутриклеточных систем в передаче сигнала от рецептора.

Jak – Янус-киназа, ассоциированная с цитокиновым рецептором. Tyk- Янус-киназа, фосфорилирующая тирозин. Stats – белок-переносчик сигнала и активатор транскрипции.

Сигнал к апоптозу проводится с помощью специфического участка семейства рецепторов ФНО, так называемого домена “смерти”. Сигнализация осуществляется не с участием Jaks и Stats, а с участием МАР-киназ. В результате с Днк связываются такие активаторы транскрипции, как АР-1, NF-κB, и NFIL-6.

Методы оценки системы цитокинов.

Комплексный анализ системы цитокинов состоит из: Оценка клеток продуцентов. - Определение экспрессии: а) рецепторов, распознающих патоген или антиген (ТКР) на уровне генов и молекулы белка (ПЦР, Метод проточной цитофлуориметри) б) адаптерных молекул, проводящих сигнал, запускающих транскрипцию цитогеновых генов (ПЦР) в) генов цитокинов (ПЦР), белковых молекул (оценка цитокинсинтезирующей ф-ци мононуклеарных клеток человека) - Количественное определение субпопуляций клеток, содержащих те или иные цитокины: Th1, Th2, Th17 (метод внутриклеточного окрашивания цитокинов); определение количества клеток, секретирующих определенные цитокины (ELISPOT) 2) Оценка цитокинов и их антагонистов в биологических средах организма. - Тестирование биологической активности цитокинов - Количественное определение цитокинов с помощью ИФА - Иммуногистохимическое окрашивание цитокинов в тканях - Определение соотношения оппозитных цитокинов (про- и противовоспалительных), цитокинов и антагонистов рецепторов цитокинов.

3) Оценка клеток мишеней. -Определение экспрессии рецепторов цитокинов на уровне генов и белковой молекулы (ПЦР, проточная цитофлуориметрия) -Определение сигнальных молекул во внутриклеточном содержимом -Определение функциональной активности клеток-мишеней. В настоящее время разработаны методы оценки системы цитокинов, дающих разноплановую информацию: -Метод количественного определения цитокинов с помощью ИФА. ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay), -Метод ELISPOT (Enzyme linked immunosspot, spot - пятно ), позволяющий выявить цитокины вокруг единичной цитокинпродуцирующей клетки, -Иммунофлюоресценция, -Молекулярно-биологические методы (исследование экспресси генов цитокинов, их рецепторов, сигнальных молекул). -Внутриклеточное окрашивание цитокинов, -Тестирование биологической активности цитокинов.

1) Количественное измерение с помощью методов иммуноанализа.

В основе метода лежит взаимодействие аг с ат, которое визуализуется с помощью специальной метки, заранее конъюгированной либо с аг, либо с ат. В качестве меток используются вещества, которые можно можно будет зарегистрировать и после измерить кол-во метки. Метки – радионуклиды, ферменты, катализирующие превращение бесцветного субстрата в цветной или флюоресцирующий продукт, флюоресцирующие и люминисцирующие вещества. В настоящее время используются твердофазные или иммуносорбентные анализы. На материале твердой фазы (полистирол, поливинилхлорид – в виде стандартно-штампованных микроплашек с 96 или 60 лунками, пористый материал – нитроцеллюлоза - в виде плоских листов или полосок сттрипов) в соответствии с фх-свойствами сорбируется аг или ат. Остальные реагенты тест-систем используются в виде растворов. Их добавляют к твердой фазе поочередно, инкубируют, после чего несвязавшиеся реагенты легко удаляют промывкой твердой фазы. Результат реакции остается на твердой фазе и регистрируется количественно. Выделяют прямой и непрямой ИФА. Прямой ИФА – анализ, в котором метку присоединяют непосредственно либо к заданному аг, либо к ат, специфичному против искомого аг. В лунки сорбируют известные аг или ат. После вносят меченые испытуемые ат или аг.

Прямой ИФА

Связывание моноклональных а.т. к подозреваемому цитокину с твердой фазой (случай б), отмывка.

Инкубация с исследуемым образцом содержащим меченые антигены ( меченые цитокины), отмывка.

Внесение субстрата. В случае если меткой является фермент.

Образование окрашенного продукта. Учет результатов на приборе.

Определение концентрации АГ (цитокина) по калибровочной кривой.

Ингибиторный ИФА

На твердой фазе иммобилизуют исследуемые аг (цитокины).

К исследуемому цитокину добавляют а.т., коньюгированные с ферментом. Добавляют испытуемую пробу, в которой нужно определить концентрацию цитокинов. Определяемый а.г. (цитокин) в испытуемой пробе конкурирует с имобилизованным на твердой фазе а.г. за растворимые антитела.

Внесение субстрата.

Измерение ферментативной активности на твердой фазе. Тем самым, чем больше цитокинов было в испытуемой пробе, тем меньше будет ферментативная активность. То есть ферментативная активность обратна пропорциональна концентрации определяемого вещества в пробе.

“Сэндвич”-ИФА. Применяется для цитокинов, с 2-мя и более неперекрывающимися эпитопами.

Антитела к одному из эпитопов сорбируют на твердой фазе. Отмывка.

Добавление испытуемой пробы, содержащей цитокины (а.г.). Инкубация. Отмывка.

Внесение а.т. коньюгированных с ферментом ко второму эпитопу. Их инкубация на втором эпитопе цитокинов (а.г.)

Добавление субстрата.

Образование окрашенного продукта. Учет результатов. Определение концентрации по калибровочной кривой. “Сэндвич”-ИФА не требует препаратов очищенных антигенов (довольно дороги). Чувствительность выше, чем при применени ингибиторного ИФА.

Иммунометрический анализ.

В пробирку с испытуемой пробой 1, предположительно содержащей определяемый аг (цитокин), вносят заведомый избыток меченых ат 3. Внесение избытка цитокина (аг), иммобилизованного на мелкодисперсной твердой фазе. Инкубация, центрифугирование, отделение растворимой фракции (супернатант). Определение ферментативной активности в супернатанте (если метка - фермент). Ферментативная активность прямо пропорциональна содержанию цитокина (аг) в испытуемой пробе. Определение концентрации цитокина по калибровочной кривой. Метод более чувствительный, нежели конкурентный ИФА.

Непрямой ИФА – анализ, в котором метку присоединяют не к аг и не к ат против целевого ат, а к ат против образовавшегося комплекса аг-ат. Меткой будет являться фермент (пероксидаза корня хрена, щелочная фосфатаза, уреаза),расщепляющий субстрат (орто-фенилдиамин,5-бромо-4-хлоро-3-индолил фосфат, мочевина), в результате чего будет меняться окраска системы.

Адгезия исследуемого а.г. (цитокина) на твердой фазе

Внесение материала со специфическими ат.

Внесение ат к комплексу аг-ат.

Добавление субстрата, образование окрашенного продукта, учет результатов.

Иммуноблот

Исследуемую смесь цитокинов подвергают электрофорезу в полиакриламидном геле. В результате чего каждый цитокин (если их несколько вариантов) в соответстви со своей молекулярной массой и электрическим зарядом занимает определенную позицию в геле. Получаем фракции, но без окраски они не видны. После применяют инкубацию с ат. Сначала специфичными к определенным цитокинам, а после с ат к образовавшемуся комплексу аг-ат, но уже коньюгированными с ферментом. Добавление субстрата, инкубация, анализ.

Можем определить – какие цитокины и в каком количестве какая клетка продуцирует.

ИФА позволяет узнать каковы точные концентрации цитокинов в биологических жидкостях организма. Преимущества: высокая чувствительность, специфичность, независимость от присутствия антагонистов, возможность точного автоматизированного учета и стандартизации учета. Минусы: не характеризует биологическую активность цитокинов, может давать ложные результаты за счет перекрестно-реагирующих эпитопов.

Метод ELISPOT На дно нитроцеллюлозного планшета сорбируют моноклональные ат против интересующего цитокина. Затем помещают в лунки культуру исследуемых клеток. Добавление стимуляторов продукции данного цитокина. Выделение цитокина клетками. Образование комплекса аг-ат. Добавление конъюгата к комплексу аг-ат с меткой-ферментом. Инкубация, промывка. Добавление бесцветного субстрата. Инкубация, промывка. В результате получаем пятна на дне лунок. Пятна образуются в тех точках, над которыми лежали антителообразующие клетки. Анализ компьютера, основанный на сравнении полученного результата с контрольным. Определение количества искомых клеток.

2) Молекулярно – биологические методы.

С помощью этих методов исследуется экспрессия генов цитокинов, их рецепторов, сигнальных молекул, а также генетически запрограмированная продукция цитокина. Выявлена связь между вариантами аллелей генов и предрасположенностью к ряду заболеваний. ПЦР-РВ, ПЦР-ОТ и флюоресцентная гибридизация in situ (FISH).

ПЦР. Метод основан на многократном избирательном копировании определённого участка ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях (in vitro). При этом происходит копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце. В отличие от амплификации ДНК в живых организмах, (репликации), с помощью ПЦР амплифицируются относительно короткие участки ДНК. Стадия денатурации - двухцепочечную ДНК-матрицу нагревают до 94—96 °C (или до 98 °C, если используется особенно термостабильная полимераза) на 0,5—2 мин., чтобы цепи ДНК разошлись. Отжиг - когда цепи разошлись, температуру понижают, чтобы праймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей. Элонгация - ДНК-полимераза реплицирует матричную цепь, используя праймер в качестве затравки. Полимераза начинает синтез второй цепи от 3'-конца праймера, который связался с матрицей, и движется вдоль матрицы в направлении от 3' к 5'. Образование продукта ПЦР-реакции. Повтор циклов n раз.

ПЦР вреальном времени (ПЦР-РВ). ПЦР-РВ (количественный ПЦР) - лабораторный метод, основанный на методе полимеразной цепной реакции, который используется для одновременной амплификации и измерения количества данной молекулы ДНК. Метод использует общие принципы ПЦР, а отличие состоит в том, что измеряется количество амплифицированной ДНК в реальном времени после каждого цикла амплификации. Для количественного анализа используют флюоресцентные красители (TaqMan), интеркалирующие в двуцепочечные молекулы ДНК и модифицированные дезокси-нуклеотиды, флюоресцирующие после гибридизации с комплементарными участками ДНК. Метод позволяет детектировать флюоресценцию каждый цикл и наблюдать рост кол-ва ПЦР-продукта в каждой пробирке, и далее по имеющейся калибровке определять точное исходное кол-во образца в пробе. Часто комбинируют с ПЦР-ОТ.

ПЦР с обратной транскрипцией (ПЦР-ОТ). ПЦР-ОТ (обратный ПЦР) - лабораторный метод, основанный на методе полимеразной цепной реакции, который используется для получения ДНК из мРНК. Для превращения последовательности РНК в комплементарную ДНК используют обратную транскриптазу: 1. Реакция первой цепочки: комплементарная ДНК образуется на матрице мРНК ферментом обратной транскриптазой. Компоненты реакции смешиваются с ДНК-праймером и буфером с обратной транскриптазой на один час при 37 °C. 2. Реакция второй цепочки: после того как обратная транскрипция закончена и образована комплементарная ДНК на матрице мРНК, следующие циклы производятся по стандартной методике ПЦР. Амплифицируем уже одноцепочечную молекулу ДНК. После 30 циклов амплификации образуются миллионы копий нужной последовательности. Нами это используется для исследования экспрессии мРНК цитокинов.

Флюоресцентная гибридизация in situ (FISH-метод). FISH реакция - цитогенетический метод, который применяют для детекции и определения положения специфической последовательности ДНК на хромосомах. Для определения расположения специфической последовательности ДНК при флюоресцентной гибридизации in situ используют флюоресцентные зонды (короткие последовательности ДНК, которые являются комплементарными по отношению к последовательностям ДНК, представляющим объект изучения) Зонды гибридизуются (связываются) с комплементарными участками ДНК и благодаря тому, что они помечены флуоресцентной меткой, дают возможность видеть локализацию интересующих генов в составе ДНК или хромосом с помощью флюоресцентных микроскопов. В отличие от других методов изучения хромосом, требующих активного деления клетки, FISH можно выполнять на неделящихся клетках, благодаря чему достигается гибкость метода.

Изучение внутриклеточного содержания цитокинов и их продукции в клетках и тканях. -Внутриклеточное окрашивание цитокинов, -Метод проточной цитофлуориметрии, - Elispot

Эти методы дают возможность изучить экспрессию цитокинов на клеточном и тканевом уровне и выявить изменение соотношения клеток, продуцирующих различные цитокины, что может отражать патогенез заболевания и быть критерием оценки прогноза и проводимой терапии. Методом внутриклеточного окрашивания определяют экспрессию цитокина на уровне одной клетки. Метод проточной цитофлуориметри предоставляет возможность идентифицировать множество различных цитокинов в различных типах клеток одновременно или подсчитать кол-во клеток, экспрессирующих тот или иной цитокин.

Нестимулированные клетки продуцируют небольшое кол-во цитокинов, к тому же они не депонируются, следовательно необходимо простимулировать клетки и заблокировать выход цитокинов наружу. Индукторов продукции цитокинов -форбол-12-миристат-13-ацетат, иономицин и блокатор внутриклеточного транспорта -брефелдин А, моненсин. После осуществляется инкубация, фиксация, пермеабилизация (обработка сапонином, повышающим проницаемость клеточной мембраны) клеток, окраска с помощью моноклональных ат к цитокину. После идет подсчет клеток на проточном цитофлуориметре.

Проточный цитофлуориметр.

4) Тестирование биологической активности цитокинов.

Спасибо за внимание.

Список использованной литературы.

1) А.Ройт, Дж.Бростофф, Д.Мейл. Иммунология. Имздательство “Мир” 2000. 2) Иммунология практикум. Л.В. Ковальчук, Г.А. Игнатьева, Л.В. Ганковская 3)Р.М. Хаитов, Г.А. Игнатьева, И.Г. Сидорович. Иммунология. 2000.