Презентация "Хромосомные аномалии в эмбриональных стволовых клетках" (9 класс) по биологии – проект, доклад

СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ И ГЕНЕТИКИ Прохорович Мария Александровна Хромосомные аномалии в эмбриональных стволовых клетках человека hESM01-04 Научный руководитель д. б. н. Рубцов Николай Борисович Новосибирск – 2008

Слайд 1 из 17 Титульный лист

Цель работы:

оценить стабильность кариотипа эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) человека в процессе культивирования и определить характеристики, по которым ЭСК с выявленными хромосомными перестройками отличаются от клеток исходных линий.

Слайд 2 из 17

Задачи:

провести цитогенетический анализ эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) человека четырёх линий – hESM01, hESM02, hESM03 и hESM04 – в процессе культивирования; 2) провести молекулярно-цитогенетический анализ состава и организации выявленных перестроенных хромосом; 3) получить и охарактеризовать дифференцированные клетки из ЭСК с нормальным кариотипом, а также из ЭСК, несущих выявленные аномальные хромосомы; 4) провести сравнительный анализ характеристик ЭСК исходных линий hESM01-04 и ЭСК, несущих аномальные хромосомы; 5) разработать метод одновременной визуализации и идентификации хромосомных территорий перестроенной хромосомы и её нормального гомолога в трёхмерном пространстве интерфазного ядра ЭСК, несущих выявленные аномальные хромосомы; 6)провести оценку влияния хромосомных перестроек на положение хромосом в интерфазных ядрах ЭСК, несущих выявленные аномальные хромосомы.

Слайд 3 из 17

Общий вид колонии hESM01

Фибробластоподобные производные клеток hESM01

Результаты иммуноокрашивания дифференцированных клеток с помощью антител против CD105 (a), пролил-гидроксилазы (б); ядра окрашены DAPI – синий цвет.

а б Общий вид клеток Слайд 4 из 17

Пример иммуноокрашивания дериватных ЭСК на маркёры плюрипотентности.

Сублиния hESM03der9. 46, XX, del(4),der(9)

r(18) der(9) 9

Иммуноокрашивание клеток hESM01r18. На фотографиях «а» и «б» представлены фрагменты колоний. а – Tra-1-60 – красный сигнал, ядра окрашены DAPI – синий цвет; б – OCT4 – зелёный сигнал.

Сублиния hESM01r18. 46, ХХ, r(18)

del(4) 4

Результаты гибридизации теломерной пробы и микродиссекционной пробы r18 на M01r .

FISH микродиссекционной ДНК пробы der(18) с хромосомами клеток сублинии hESM01r18

FISH теломерной ДНК пробы с хромосомами клеток сублинии ESM01r18

der(18)

Реорганизация хромосомы 18 в клетках сублинии ESM01r18

Слайд 6 из 17

Результаты гибридизации микродисс пробы r18 на нормальные хромосомы

FISH микродиссекционной ДНК пробы der(18) c метафазными хромосомами лимфоцитов взрослого человека с нормальным кариотипом

18(p11.31q21.2) Слайд 7 из 17

Результаты гибридизации микродисс пробы r18 на M01r – внимательное рассмотрение

Реорганизация хромосомы 18 в клетках сублинии hESM01r18

Слайд 8 из 17

Реорганизация хромосомы 4 в клетках сублинии hESM03der9

FISH микродиссекционной комбинированной ДНК пробы del(4) а - с хромосомами клеток сублинии hESM03der9; б - с хромосомами лимфоцитов здорового донора (фрагмент пластинки).

del(4)(q25q31.1)

Реорганизация хромосомы 9 в клетках сублинии hESM03der9

Схема микродиссекции нормальной хромосомы 9 и der(9) для получения хромосомоспецифичных проб WCP9 и WCPder(9), а также районоспецифичных проб PCPder(9)-p, PCPder(9)-1, PCPder(9)-2 и центромерной пробы PCPC

Схема микродиссекции хромосом 9 и её деривата

Слайд 10 из 17

FISH хромосомоспецифичной WCPder(9) (красный цвет) и прицентромерной PCP9C (жёлтый цвет) микродиссекционных ДНК проб с хромосомами клеток сублинии hESM03der9.

dup(9)(q12q33)

Пример гибридизации микродисс проб из материала хромосом 9 и её деривата на дериватные хромосомы

Слайд 11 из 17

FISH c хромосомами клеток сублинии hESM01r18 ДНК пробы, приготовленной на базе клонированного фрагмента ДНК из района делеции.

Оптические срезы двух ядер (три проекции).

Совместная 3D FISH ДНК пробы, маркирующей нормальный гомолог хромосомы 18, и хромосомоспецифичной пробы WCP18, окрашивающей хромосомные территории хромосомы 18 и её деривата. Ядра окрашены DAPI – синий цвет.

Визуализация и идентификация хромосомных территорий хромосомы 18 и её деривата

Трёхмерная реконструкция хромосомных территорий хромосом 18 и r18 в ядрах клеток hESM01r18

Серии оптических срезов.

Локализация хромосомных территорий хромосом 18 и r(18) в клетках сублинии hESM01r18

3D реконструкция хромосомы 9 и её деривата в пространстве интерфазного ядра клетки сублинии hESM03der9

3D FISH хромосомоспецифичной WCPder(9) (зелёный цвет) и прицентромерной PCP9C (красный цвет) ДНК проб с ядрами ESM03der9.

Выводы

Получены две сублинии ЭСК, отягощённые хромосомными перестройками, в то же время показано, что при проведении регулярного мониторинга состояния кариотипа возможно проведение длительного культивирования клеток hESM01-04, не сопровождающееся тотальной дестабилизацией кариотипа. Детально охарактеризованы выявленные аномальные хромосомы, являвшиеся производными хромосом 4, 9 и 18, с помощью полученного комплекта микродиссекционных проб. 3) Показано, что, несмотря на сохранение «маркёров плюрипотентности», способности к дифференцировке ЭСК, отягощённых выявленными хромосомными аномалиями, снижены по сравнению с клетками исходных линий hESM01-04.

Выводы (первая часть)

Слайд 16 из 17

4) Разработан метод одновременной визуализации и идентификации хромосомных территорий хромосомы 18 и её деривата в клетках hESM01r18, хромосомы 9 и её деривата в клетках hESM03der9. 5) На примере хромосомных территорий хромосом r18 и её нормального гомолога показано, что хромосомная перестройка сопровождалась изменением локализации перестроенной хромосомы по сравнению с локализацией её нормального гомолога относительно периферической области ядра и ядрышек. На примере аномалии хромосомы 9 в клетках hESM03der9 и их дифференцированных производных показано, что дуплицированный район, содержащий последовательности, гомологичные прицентромерным повторам, локализуется предпочтительно в периферической области ядра, также как и прицентромерные районы хромосом 9 и её деривата.

Выводы (вторая часть)

Слайд 17 из 17

Спасибо за внимание!

3D FISH хромосомоспецифичной WCPder(9) (зелёный цвет) и центромерной PCP9C (красный цвет) ДНК проб с ядрами hESM03der9.

3D реконструкция хромосомы 9 и её деривата в пространстве интерфазного ядра клеток сублинии hESM03der9

Здесь лучше видны районы хромосом 9 и её деривата в пространстве, показано как исключить дапийный канал

Обозначение районов хромосомы 9 и её деривата. 9N - прицентромерный район хромосомы 9, 9С – прицентромерный район хромосомы der(9), dup9 – дополнительный сигнал на хромосоме der(9). Хромосомы окрашены красным, сигналы жёлтым.

Один из вариантов локализации районов dup9, 9С и 9N в ядрах клеток hESM03der9 и в ядрах дифференцированных клеток, полученных на основе hESM03der9.

Локализация трёх районов хромосомных территорий хромосом 9 и der(9) в клетках hESM03der9 и их дифференцированных производных

Один из вариантов локализации районов dup9, 9С и 9N в ядрах клеток hESM03der9 и в ядрах дифф клеток, полученных на основе hESM03der9. И обозначение районов dup9, 9N, 9C.

Варианты локализации части хромосомной территории относительно границы ядра и ядрышка. (С 1) – одной стороной лежит в периферической области ядра; (С 2) – двумя сторонами лежит в периферической области ядра; (C nu) – касается ядрышка, (С 1 + nu) – одной стороной касается ядрышка, другая лежит в периферической области ядра; 0 - не касается ядрышка и не лежит в периферической области ядра. Зелёным обозначены варианты локализации части хромосомной территории, красным – ядрышки.

Схема: как мы анализировали положение районов девятых хромосом.

Экспрессия специфических маркёров, выявленная с помощью моноклональных антител

Пример иммуноокрашивания нормальных ЭСК на маркёры плюрипотентности и эмбриоидных телец из них на тканеспецифические маркёры

Сравнение свойств клеток сублиний hESM01 и hESM01r18

Способность дифф в эмбриоидные тельца дериватных клеток

Сравнение свойств клеток сублиний hESM01 и hESM01r18, hESM03 и hESM03der9

Сравнение скорости роста клеток дериватных и исходных сублиний

Дифференциальное окрашивание хромосом в аномальных ЭСК

Слайд 5 из 17

Гены в хромосоме 18