Презентация "Трансгенез. животные" по биологии – проект, доклад

ОСНОВЫ БИОТЕХНОЛОГИИ

ТРАНСГЕНЕЗ. ЖИВОТНЫЕ. Лекция 7

Словарь

Зигота – тотипотентная диплоидная клетка, образующаяся в результате оплодотворения (слияния яйцеклетки и сперматозоида) Бластоциста – зародышевый пузырек, ранняя (преимплантационная) стадия развития зародыша млекопитающих (в том числе человека

Что означает термин «трансгенные животные»?

humbio.ru

Трофобласт – наружный клеточный слой бластоцисты млекопитающих, принимает участие в имплантации и формировании плаценты

Синцитиотрафобласт – выполняет функцию всасывания питательных веществ из крови матери, вырабатывает ферменты, способствующие внедрению ворсин хориона в ткани матки

1. Оплодотворенная яйцеклетка (зигота) 2. Зигота делится надвое 3-4. Митотическое деление продолжается 5. Через 5-6 дней образуется бластоциста 6. Внутреннюю часть бластоцисты (ВКМ) помещают на питательную среду для получения стволовых клеток

http://www.vokrugsveta.ru

Этапы получения трансгенных животных (до принятия решения об интродукции)

Создание и амплификация rДНК (кассета экспрессии+вектор) Выбор и подготовка клеток-реципиентов для трансформации Встраивание трансгена в геном клетки-реципиента Отбор трансгенных организмов Отбор трансгенных организмов, образующих трансгенные гаметы Получение чистых линий Оценка экспрессии гена

В 1982 году Р.Д.Пальмитер с коллегами опубликовали фотографию, на которой рядом сидели две мыши. Одна из них была трансгенной, в ее ДНК встроили ген гормона роста крысы, другая была обычной мышкой.

Металлотионеин - белок, способный связывать двухвалентные металлы. Регулирует концентрацию в клетке микроэлементов (цинк и медь).

Схемы получения трансгенных животных Микроинъекция в зиготу

микроинъекция чужеродной ДНК в оплодотворенную яйцеклетку (зиготу)

1. Создание и клонирование кассеты экспрессии составе вектора клонируется в E. Coli 2. Получение одноклеточных зигот 3. Выделяние rДНК, переведение в линеарную форму, инъецирование в пронуклеус зиготы. 4. пересадка эмбрионов самкам-реципиентам 5. отбор трансгенных животных, продуцирующих трансгенные гаметы

http://www.transgen.ru

1. встроился ли трансген в геном? 2. несут ли трансген гаметы? 3. экспрессируется ли трансген?

Основные проблемы

Схема введения генов и установления гомозиготной линии мышей с помощью микроинъекций

MDR1- ген множественной лекарственной устойчивости

Схемы получения трансгенных животных Реконструкция эмбрионов с использованием ЭСК (эмбриональных стволовых клеток)

микроинъекция чужеродной ДНК в ЭСК

1. Получение культуры ЭСК 2. Введение в ЭСК rДНК с селективных маркером (с помощью ретровирусов, электропорации, липосом) 3. Получение бластоцист для микроинъекции 4. Конструирование химерных эмбрионов 5. Пересадка эмбрионов самкам-реципиентам 6. отбор трансгенных животных, продуцирующих трансгенные гаметы

http://rudocs.exdat.com

http://www.stemcells.ox.ac.uk

Инъекция в бластоцисту

http://www.tankonyvtar.hu/

Способы введения днк в культивируемые клетки животных

Рекомбинантные РНК-вирусы Клетка с помощью рецепторов опознает вирусную оболочку. Вирус внедряет в клетку РНК. В клетке РНК с помощью ревертазы переписывается в ДНК ДНК проникает в ядро соматической клетки. ДНК встраивается в ДНК клетки. Клетка синтезирует копии обновленного генома и мРНК. Белки транслируются РНК вируса одеваются вирусной оболочкой выходят из клетки, заражая новые поколения клеток.

moikompas.ru

Перенос генов с помощью вирусов (Эффективные векторы созданы на основе ретровирусов, вирусов SV40, аденовирусов, аденоассоциированных вирусов, вируса осповакцины, вируса герпеса и др.)

Структура экспрессирующего вектора pKSV-10 для трансгенеза животных

рисунок из книги Л.И. Патрушева Экспрессия генов, 2004

Перенос генов, опосредованный клеточными рецепторами основан на интернализации рецепторов в процессе эндоцитоза

Электропорация. Кратковременное (10 мксек-100 мсек) воздействие электрическим полем высокой напряженности (50-1500 V/см), вызывает локальное нарушение целостности мембран с образованием микропор (диаметр 20-120 нм), через которые заряженные молекулы, в том числе и ДНК, как линейная, так и суперскрученная, проникают внутрь клеток

Основные стратегии в трансгенезе животных. Внедрение в практику.

Создание новых животных, с улучшенными качественными и количественными характеристиками (лосось с трансгеном гормона роста)

Создание новых животноводческих пород, дающих продукты с повышенным содержанием некоторых компонентов (например, в Великобритании существует стадо коров, молоко которых подходит для приготовления сыра чеддер).

Создание животных, способных продуцировать несвойственные их виду белки (например, сообщалось о получении свиней, способных продуцировать интерферон человека).

Создание трансгенных животных, являющихся донорами при трансплантациях органов. (например, из стволовых эмбриональных клеток животных вырастили глаза и уши лягушки).

Получение геномных библиотек – полное собрание генома человека, распределенное по отдельным «томам» рекомбинантных молекул плазмид или фаговых частиц «в суперобложке» бактерии E.coli.

Схема получения геномной библиотеки. Метод дробовика

Схема получения библиотеки кДНК

ДНК-зонды alko-mir.ru

ДНК-зонд (англ. DNA probe) – фрагмент ДНК, меченный тем или иным образом и использующийся для гибридизации со специфическим участком молекулы ДНК. Позволяет идентифицировать комплементарные ему нуклеотидные последовательности.

ДНК-зонды.

Зонды с комплементарными концевыми последовательностями (molecular beacons)

Зонды с резонансным переносом энергии (LightCycler assay)

Концевые последовательности зонда комплементарны и образуют шпильки, что гасит свечение. Зонды, которые отжигаются на матрицу, разворачиваются, и флуоресцентная метка и гаситель расходятся в разные стороны - увеличивается свечение.

Принцип метода в переносе энергии от одного флуорофора (на 3` конце первого зонда), ко второму флуорофору (на 5` конце второго зонда). При связывании зондов с ДНК матрицей испускаемое первым флуорофором излучение передается на второй флуорофор, а его излучение детектируется прибором.

http://www.interlabservice.ru/

Схема получения кДНК.

http://bannikov.narod.ru/

Генная терапия

в генной терапии наследственных болезней применяют векторные системы на основе: лентивирусов аденовирусов аденоассоциированных вирусов ортопоксвирусов герпесвирусов РНК-вирусов, не относящихся к ретровирусам

http://supotnitskiy.webspecialist.ru/

Сравнение свойств генотерапевтических векторных систем

Таргетинг (target - мишень) – изменение генов за счет гомологичной рекомбинации последовательностей, находящихся в хромосоме, с искусственно введенными в клетку последовательностями ДНК Упаковывающая клетка – линия клеток, созданная для продуцирования (упаковки) вирусных частиц, не содержащих инфекционных нуклеиновых кислот.

Схема переноса генов с использованием ретровирусных векторов

1. Клонирование гена в ДНК ретровирусного вектора в клетках E.coli. 2. Перенос ДНК ретровирусного вектора в упаковывающие клетки. 3.Формирование ретровирусных частиц и их выход в культу ральную среду. 4. Трансдукция гена в составе ретровирусного вектора в клетки-мишени.

Методы модификации вирусов

физический таргетинг – покрытие вирусной частицы специальной оболочкой, изменяющей ее природный тропизм и делающей ее неузнаваемой для иммунной системы человека генетическая модификация вируса – модификация белков оболочки вектора транскрипциональный таргетинг – введение в трансген-экспрессирующую кассету специфических для данных тканей промоторных последовательностей.

http://www.mun.ca

Успехи и неудачи генной терапии

17 сентября 2000 г. в Университете Пенсильвании умер 17 летний Джесси Гелзингер, которого пытались вылечить от наследственного заболевания печени недостаточность орнитинтранскарбомилазы (OTCD). Он умер из-за гиперреакции имунной системы на ввод в печень генно-инженерного аденовируса. Смерть наступила вследствие острого респираторного синдрома и выхода из строя множества органов.

http://humbio.ru

Первая успешная попытка лечения тяжелого обычно несовместимого с жизнью наследственного иммунологического заболевания, вызванного дефектом в гене, кодирующем фермент аденозиндезаминазу, была осуществлена в 1990 г. В. Андерсеном с соавт.

David Phillip Vetter 21.09.1971, - 22.02.1984

Джесси Гелзингер